CAS9设计网站的使用教程 随着基因工程的进步，越来越多的研究者开始关注CRISPR/CAS9系统，该系统可以在细胞内剪切DNA，并插入新的DNA序列，以扩展或修改基因组。在使用CRISPR/CAS9系统进行基因编辑前，需要通过CAS9设计网站进行设计。下面将介绍CAS9设计网站的使用教程。 1.打开CAS9设计网站 首先，在浏览器中输入“https://chopchop.cbu.uib.no/”，打开CAS9设计网站。 2.输入目标序列 在网站首页中，可以看到一个文本框，将目标基因或DNA序列复制到该文本框中。 3.选择目标基因 根据实际需求，在下拉菜单中选择目标基因。如果您的目标是人类基因，则应选择“Human GRCh38”. 4.选择PAM序列 在CAS9系统中，PAM序列指与CAS9结合的RNA序列。目前广泛使用的PAM序列为“NGG”，也就是核苷酸N的3'位置为G，核苷酸G的5'位置为G。如果您使用的是其他的PAM序列，则需要在“PAM Sequence”文本框中手动输入该序列。 5.运行计算 所有的参数都已设置好，接下来单击“Design”按钮。系统将为您生成建议的指针RNA序列和要插入或删除的特定DNA序列。 6.修改并保存结果 修改RNA序列参数，比如改变目标序列或PAM序列，再次单击“Design”按钮。您可以在网站上注册，保存您的CRISPR设计来随时查看您的结果。 CAS设计：基因工程中的重要途径 在基因工程中，CAS（CRISPR-associated）是目前最常用的一种天然的病毒防卫和基因剪切系统。CAS9是CRISPR/CAS系统中的酶，其基本构造由两个分子组成：CRISPR RNA（crRNA）和转录前标记RNA（tracrRNA），与Cas9酶形成复合物。以下是CAS9的设计和应用。 1.CAS9的设计 设计CAS9分子的最简单方法是利用CRISPR RNA（crRNA）的序列与目标基因的DNA序列互补。另一种方法是将一个可编程RNA外导序列附加到crRNA的3'端。此外，还需要在CAS9分子中使用NGG和NAG PAMs的识别序列，以及在CRISPR/CAS9系统之前确定有没有存在找到完美匹配DNA片段的位点。 2.CAS9的应用 以人类细胞为例，在CRISPR/CAS9系统中，两个RNA异质体：crRNA和转录前标记RNA（tracrRNA）可以由同一个小RNA合并成单个RNA molecle。在出现完全互补的目标DNA序列后，CAS9依靠其核酸裁剪能力特异性地剪切该序列。这种高精准度使得该技术在研究癌症、人类遗传病以及可及性治疗方面具有极大的应用前景。 3. CAS9的挑战 尽管CRISPR/CAS9系统是最常用的基因编辑方法之一，但仍存在一些挑战与限制。如不能高效而准确地优化目标基因的编辑，必须发掘出已存在于所有细胞中的PAM序列才能实现编辑，必须减轻剪切位点的错误编辑率等。 结论 通过CAS9设计网站，我们可以更快、更准确地设计基因工程项目中的指针RNA序列，完成便捷灵活的基因编辑。同时，CAS设计为基因工程提供了一种广泛使用的、低成本的基因编辑方法，并且应用领域有望继续扩展。